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青岛地区家族性及早发性乳腺癌BRCA1基因外显子2 ,20突变研究

来源: 2011-08-19 15:46:19

[1]青岛地区家族性及早发性乳腺癌BRCA1基因外显子2 ,20突变研究

张磊, 吴琍, 曹明智, 周岩冰

(青岛大学医学院附属医院乳腺外科,山东 青岛 266071)

[摘要] 目的 研究青岛地区家族性及早发性乳腺癌中 BRCA1基因外显子2,20的突变情况及突变位置,探讨其与乳腺癌发病的关系。 方法 选取青岛地区家族性乳腺癌患者(家系中至少有一个一级亲属乳腺癌患病史)30例、早发性乳腺癌(发病年龄<35岁)25例为实验组;20例乳腺良性肿物患者为对照组。应用PCR技术和DNA直接测序技术检测所有标本BRCA1基因外显子2、20的突变情况。结果 实验组与对照组在外显子2和20的序列中均未发现有突变。结论 BRCA1基因外显子2和20上的序列突变对中国青岛地区家族性及早发性乳腺癌发生的影响不大,有待于在中国青岛地区家族性及早发性乳腺癌患者中寻找BRCA1基因的其它突变热点。

[关键词] 乳腺癌 ; BRCA1基因; 突变

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A

BRCA1 GENE EXON2 AND EXON20 MUTATION DETECTION OF FAMILIAL BREAST CANCER AND EARLY-ONSET BREAST CANCER FROM QINGDAO IN CHINA

ZHANG LEI,WU LI ,CAO MINGZHI,ZHOU YANBING(Department of Breast Surgery , the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College , Qingdao 266071, China)

[Abstract] Objective To detect the mutation sites of BRCA1 gene exon2 and exon20 in patients with breast cancer and to study the relationship between BRCA1 gene mutation and breast cancer. Methods The partial exons(2,20)of BRCA1 gene in 30 breast cancer patients who had one first-degree relative affected and 25 patients suffered from breast cancer at age of less than 35 year and 32 cases of benign breast diseases were analyzed by polymerase chain reaction(PCR) and DNA sequencing. Result No mutations were found in exons 2 and 20. Conclusions It is indicated that gene sequence of what we have studied doesn't account much for occurrence of the familial breast cancer and early-onset breast cancer in Qingdao,China. It is important to find new mutations in BRCA1 gene.

[Key words] breast cancer;BRCA1 gene;mutation

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,可分为散发性和遗传性两类,其中遗传性乳腺癌约占乳腺癌发生率的5-10%。乳腺癌易感基因BRCA-1 (breast cancer susceptibility gene , BRCA-1) 是近年来发现的一种重要的肿瘤抑制基因。近年来研究表明BRCA1基因结构和功能的异常与45%的家族性乳腺癌、卵巢癌有关[1],其基因突变可以常染色体显性遗传方式传递给子代。对BRCA1 基因进行检测,寻找其致病突变位点,可帮助筛选出高危人群,有助于风险评估和早期诊断;同时也可为未来的高危人群基因筛查和基因诊断提供基本突变谱资料。BRCA1基因在世界各地不同地区乳腺癌中的突变有差异,它在中国青岛地区乳腺癌的突变情况尚未见文献报道。本研究拟应用PCR及DNA直接测序的方法分析30例家族性乳腺癌及25例早发性乳腺癌患者的BRCA1第2外显子和第20外显子序列,探讨中国青岛地区家族性乳腺癌BRCA1基因的突变情况。现报告如下:

1 对象与方法

1.1 对象

收集青岛大学医学院附属医院病理科2005~2007年的经病理确诊的乳腺癌石蜡包埋标本55例,其中包括:(1)家族性乳腺癌(家系中至少有两人诊断为乳腺癌)30例;(2)年龄小于35岁乳腺癌25例。同时取乳腺良性肿物患者20例为对照组,抽取2ml静脉EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝血置-20℃冰箱备用。

1.2 方法

1. 2.1 DNA的提取

从青岛大学医学院附属医院病理科取石蜡标本。切取层厚为5um的石蜡切片5-6层于1.5mlEP管中,应用“碧云天”公司的基因组DNA小量提取试剂盒(D0063)从石蜡标本中提取基因组DNA。对照组取血后当天从全血中提取淋巴细胞,将细胞裂解,按常规的酚/氯仿法提取DNA,溶于TE液中,-20℃保存备用。DNA的纯度及含量经紫外光分光光度仪(Beckman DU640 specto2photometer) 测定,-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据文献[2,3] ,在BRCA1存在突变热点的区域选择设计两对引物Exon2和Exon20(均由大连宝生物工程公司合成),其中第一对引物用于特异性地扩增BRCA1基因序列(GeneBank.L78833)第4 557~4 814位的258个碱基,引物序列如下:上游引物5′-GAA GTT GTC ATT TTA TAA ACC TTT -3′,下游引物5′- TGT CTT TTC TTC CCT AGT ATG T-3′。第二对引物用于特异性扩增BRCA1基因序列第71 518~71 918位的401个碱基,引物序列如下:上游引物5′- ATA TGA CGT GTC TGC TCC AC-3′,下游引物5′- GGG AAT CCA AAT TAC ACA GC-3′。

1.2.3 PCR扩增

PCR反应体系及条件总反应体系50μL,内含DNA模板1μg(根据DNA模板浓度添加),2×PCR TaqMix25μL,上下游引物(浓度各为10μM)2μL,超纯水补足反应体积至50μL。PCR循环参数:预变性95℃,2min;变性94℃,2min;退火50℃,1min;延伸72℃,36s,共35个循环。末轮循环72℃延伸10min。

1.2.4 PCR产物鉴定

取5μL PCR扩增产物并加入1μL Loading buffer,经2.0%含有EB的琼脂糖凝胶电泳鉴定,其余的置于-20℃保存备用。

1.2.5 PCR产物直接测序

将PCR扩增产物各40μL送至上海生工生物工程技术有限公司进行双向测序。将序列测定结果同GenBank中 cDNA BRCA1(U14680)正常的基因序列进行对照,判断有无基因突变,然后再将所检测到的BRCA1突变位点在乳腺癌信息中心网站数据库(Breast Cancer Information Core,BIC)对照,判断是否为致病性突变位点。

2 结果

2.1 PCR扩增

55例乳腺癌BRCA1基因的2和20外显子的PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶电泳检测均显示单一条带,与对照组的相应片段长度一致,说明患者BRCA1基因在所检测的片段上没有明显的插入或缺失(图1,2)。

图1 PCR扩增产物(Exon2)

右起标准分子量(下起100、200、300bp)

左起第1道为良性肿物、其余泳道为乳腺癌患者

图2 PCR扩增产物(Exon20)

右起标准分子量(下起100、200、300、400bp)

左起第1道为良性肿物、其余泳道为乳腺癌患者

2.2 DNA测序

本实验检测的55例乳腺癌患者,经DNA直接测序,并将序列测定结果同GenBank中 cDNA BRCA1(U14680)正常的基因序列进行对照,在外显子2和20的序列中均未发现有突变。

3 讨论

1990年Hall等【4】用连锁分析的方法发现早发性家族遗传性乳腺癌的发生与染色体17q21的一个基因突变有关,并将其命名为BRCA1。1994年Miki成功地克隆此基因,从此对BRCA1的功能、突变情况及其与乳腺癌、卵巢癌发生关系的研究迅速深入开展起来。BRCA1定位于染色体17q21,约占染色体组DNA的10万个碱基范围,包括22个外显子,其中最大的外显子11约为3.4个Kb,表达7.8Kb的mRNA和1836个氨基酸的蛋白质,分子量为20万道尔顿。BRCA1蛋白的氨基酸末端含有一个在许多核酸结合蛋白中发现的锌指结构,这提示BRCA1可调节基因表达。大量的实验结果表明BRCA1为一种抑癌基因, 其编码抑癌蛋白,具有DNA损伤修复、转录活化与抑制、细胞周期的调节作用、中心体复制的负性调节作用等对肿瘤生长起负性调节作用,其突变和低表达是诱发乳腺癌的主要原因之一。

到目前为止,已确定了100多种BRCA1的种系突变,包括错义突变、无意义突变、移码突变、缺失突变等,这些突变散在分布于22个编码外显子,其中突变位点以外显子11(约45%),外显子2(约18%),外显子20(约9%)为多见。有些突变在某种族中较为频发,但目前还未发现有普遍意义的突变热点。BRCA1突变的频率和类型与种族、地域有一定的关系。,有关BRCA1突变研究资料多来源于国外,国内资料较少。本研究选择中国青岛地区家族性乳腺癌患者(家系中至少有一个一级亲属乳腺癌患病史)30例及早发性乳腺癌(发病年龄<35岁)25例,对BRCA1中的高发突变位点第2及20外显子进行序列分析。测序结果与GeBnank中的BRCAlcDNA序列(登录号u14680)比较。结果显示在外显子2和20的序列中均未发现有突变。

Annika等【5】 研究瑞典24例家族性乳腺癌-卵巢癌患者中BRCA1突变率为75%,其早发性乳腺癌(≤40岁)BRCA1突变率为23%;Corski B 等【6】 检测波兰35例家族性乳腺癌BRCA1突变率为34.3%,而1995年Inoue等【7】人对日本18个乳腺癌家族及2个卵巢癌家族的研究,仅检测到2例乳腺癌存在突变;新加坡学者在76例中国妇女乳腺癌患者中检测到6例突变,突变率为8.6%【8】,在中国有关BRCA1基因突变的报道例数不多,赖春宁等【9】 检测186例散发性乳腺癌BRCA1突变率为7%。均低于欧美国家。这可能是肿瘤相关基因在不同环境、不同种族中作用程度各不相同【10】,也说明在BRCA1之外还存在其它乳腺癌相关基因,故尚需扩大样本和检测范围来进一步研究。

目前对BRCA1检测方法除了DNA直接测序技术,还有单链构象多态性(singlestrand conformation polymorphism ,SSCP) 分析法以及蛋白截断实验(protein truncation test ,PTT),工作量都较大,也不能检测到所有的突变,因此给临床应用带来不便。但对于高危人群进行BRCA1突变检测,以早期发现突变携带者,及时采取一些预防措施有一定意义。BRCA1的进一步研究对阐明乳腺癌发病机制和临床上乳腺癌的防治都有一定的重要意义。

.[参考文献]

[1] Irminger FI,Siegel BD,Leung WC.The functions of breast cancer susceptibility gene1(BRCA1)product and its associated proteins[J].Biol Chem,1999,380 (2):117-128.

[2] Sakorfas GH,Tsiotou. Genetic predisposition to breast cancer: a surgical perspective[J]. Br Surg,2000,87 (2):149-162. [3] Petr Pohlreich,Miehal Zikan,Jana Stribrna,et a1.High proportion of recurrent germine mutations in the BRCA1 gene in breast and varian cancer patients from the Prague area [J].Breast Cancer Research,2005,7 (5):R728-R736

[4] Hall JM,Lee MK,Newman B,et al.Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21[J]. Science,2001,236(2):1684-1689.

[5] Annika Bergman,Anna Flodin,Yvonne Engwall,et a1.A high Frequeney of germline BRCA1/2 mutations in western Sweden detected with complementary screening techniques[J]. Familial Cancer,2005,4(2):89-96.

[6] Gorski B,Byrski T,Huzarski T.et a1.Founder Mutations in the BRCA1 Gene in Polish Families with Breast-Ovarian Cancer[J].Am J Hum.Genet,2000,66(6):1963-1968.

[7] Monteiro AN. BRCA1:exploring the links to transcription [J]. Trends Biochem Sci,2000,25(10):469-474.

[8] Sng JH,Chang J,Feroze F,et al.The prevalence of BRCA 1 mutations in Chinese patients with early oneset breast cancer and affected relatives[J].Brit J cancer,2000,82(3):538-542

[9] 赖春宁 ,江泽飞 ,宋三泰 .186例乳腺癌患BRCA1基因突变检测 [J] 中华肿瘤杂志,2001,23(6):483-485.

[10] 胡震,李文凤等. 中国乳腺癌患BRCA1基因的频发突变 5589de18[J] 中华医学遗传学杂志,2007,24(4):378-381.

图1 PCR扩增产物(Exon2)

右起标准分子量(下起100、200、300bp)

左起第1道为良性肿物、其余泳道为乳腺癌患者

图2 PCR扩增产物(Exon20)

右起标准分子量(下起100、200、300、400bp)

左起第1道为良性肿物、其余泳道为乳腺癌患者

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[作者简介] 张磊(1978-),男,青岛大学医学院在读硕士。

[通讯作者] 吴琍(1967-),女,硕士,副主任医师,硕士研究生导师。

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